来源:正一 浏览人数:45 次更新时间:2022.09.20
在专业的PCR实验(比如临床PCR检验实验室)室通常有四区隔离(或至少是三区隔离)的要求。
常见的三区指的是:
1、试剂配制区:PCR反应体系的配置区域。
2、标本处理区:包括扩增模板的制备,也就是我们常常提取DNA的地方;
3、PCR扩增和产物分析区:进行PCR扩增的区域,也是扩增产物进行凝胶电泳分析的区域。
如果将PCR扩增区域和产物分析区再次分开,就是四区隔离了。
四区隔离,主要目的是防止气溶胶在各个PCR区域之间的流动—最好的方法是干脆每个区域隔一幢楼,那肯定是最佳的隔离措施了,但操作起来肯定不现实,于是便有了针对不同区域设置正负压的方法:
试剂配制区(Ⅰ区):最洁净的区域,保持微正压使得外界空气无法进入隔离污染源。并且阴性模板应该在此区加入PCR管并盖盖,严禁在此区域打开、存放装有DNA模板的离心管;
DNA模板添加区(Ⅱ区):保持微负压,保证内部空气不外泄,以免阳性模板的气溶胶对外界环境造成污染。
扩增及PCR产物分析区(Ⅲ区):保持微负压,使得内部空气不外泄,以免扩增产物的气溶胶对外界环境造成污染。
操作时遵循Ⅰ区→Ⅱ区→Ⅲ区单一方向进行,不可逆向进行。
对于科研用途的PCR实验室,如果无法达到严格的三区隔离的要求,至少也要做到两区隔离:即正压区和负压区。正压区实施Ⅰ区的功能,负压区实施Ⅱ区,Ⅲ区的功能。
最忌讳也是最可怕的是反过来,在正压区实施Ⅲ区的功能。我们有个用户的所有实验室都是正压—因为进入实验室的空气都是经过过滤的。他信心满满地认为他们的实验室超干净,做PCR绝对没问题,但他们实验室出现了最严重的PCR产物污染问题—所有的阴性对照都是阳性。所以PCR实验室的洁净度是次要的,不同区域间的空气是互相之间否有流通才是最关键的。
如果有的同学问,我们的实验室没有正负压的区分,或者是全负压,全正压怎么办呢?那我们的建议是:别怕麻烦,找个远离Ⅲ区(通俗地讲就是打开PCR扩增产物的盖子区域,比如电泳区)的实验室当作PCR I区使用,能省掉后续更多的麻烦。
既然PCR三区隔离的目的是为了阻断气溶胶的交流,请注意以下细节,思考一下气溶胶来自哪里:
1. 如果条件允许,在PCRⅢ区工作结束后再次进入PCR I区需要更换实验服、一次性鞋套、帽子、手套。
2. 每个区域都应配备专用的移液器吸头,不可交叉混用。
3. 每个区域都应配备专用的移液器,不可交叉混用。我们的一位用户拿电泳室的移液器加模板,阴性对照扩出了很亮的条带。
4. 在PCR I区、PCRⅡ区配备带滤芯吸头。
很多做PCR的同学会将做PCR的吸头灭菌、或者是在超净台做PCR操作。但在小编看来这完全没有必要,因为做好PCR最重要的是防止扩增产物的污染,而不是无菌操作!试想一下,高压灭菌了又如何,DNA并不会因此而降解多少,如果细菌的DNA会参与PCR扩增,那么无论活菌或是细菌尸体都一样能扩增出DNA 条带。