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PCR实验室核酸污染避坑指南《二、造成核酸污染的原因》

来源:正一 浏览人数:58 次更新时间:2022.10.21

结合我们3年的临床经验, 

总结了PCR实验室核酸污染避坑指南!




二、造成核酸污染的原因



原因分类

1. 硬件

严格的PCR实验室应有标准的正负压系统及四分区(或三分区),实验室应按照生物安全二级实验室及PCR实验室设计基本要求来建设。可参考的标准为《GB50346-2011建设标准生物安全实验室建筑技术规范》及卫健委下发的《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》。标准实验室如下图:

医疗口的实验室大多符合要求,在科研口和农业口的实验室应重视实验室的规范性建设!软件配置应按照卫健委相关技术文件规定,人员配置应专区专人,人员不可不同分区混用,物流、人流、气流做到单向流动!

临床上,门诊的新冠快检PCR实验室(或免提取方法)多半不规范。没有严格按照标准PCR实验室建设,更加容易发生污染。三分区(或二分区)、缓冲间、正负压、人员配置2人以上,这些基本要求没有达到,更加容易发生气溶胶污染。

2. 生物安全柜

现有技术指导原则,只要求了选择BSL-Ⅱ级生物安全柜,但并未规定具体型号。从临床经验来看,只有B2型生物安全柜可以用于加核酸模板。

核酸采样亭

A1型、A2型、B1型,循环风很容易造成核酸气溶胶的形成,从而造成污染,且污染很难清除。B2型为全排放,无循环风,可以用于加核酸模板。

3.常见的消毒措施并不能有效降解核酸

紫外灯能杀灭病毒,但是《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》指出,短片段的基因核酸对紫外线损伤不敏感。

常规消毒剂如酒精、碘化物、戊二醛类、季铵盐等虽然能杀菌,但是不能降解核酸,或降解效率较差。

尤其是酒精,它其实是核酸提取试剂中的一个组分,对核酸没有任何降解作用。已知的消毒剂中,次氯酸盐类消毒剂可以一定程度降解核酸,但是腐蚀性强,不能处理精密仪器及金属制品,容易腐蚀移液器吸杆影响tip头气密性。

4. 那些容易忽视的操作细节

吸取阳性对照(质粒)没有遵循“慢吸快打”的原则(这个需要练习形成“肌肉记忆”),新手往往是“快吸快打”,造成阳性样品污染枪头,或者在生物安全柜循环风的影响下,造成气溶胶飞溅,污染加样区域。应使用带有滤芯的枪头。

产品名称:移液器枪头

带滤芯枪头

4.2 加样区没有放置台面垃圾桶:应把加完样的tip枪头,丢入含有次氯酸溶液的加盖垃圾桶中。因为次氯酸容易挥发,因此应每天都要更换含氯消毒液!

5.污染高风险区域

在笔者的临床实践中,发现以下区域存在阳性污染的概率更大:

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污染风险排行榜:

2区>3区>1区;

生物安全柜>核酸提取仪>移液器>PCR扩增仪(PCR管密封性)>离心机;

阳性质控品>强阳性样本>PCR扩增产物(无UNG技术)>PCR扩增产物(UNG技术),PCR管密封性是扩增产物是否引起污染的关键。

如同,幸福的家庭都一样,不幸的家庭各有各的不幸。同理,规范的实验室都一样,污染的实验室各有各染情况。以上数据仅供参考。

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